冷藏肉中致病菌的三重ERA快速检测

doi:10.12141/j.issn.1000-565X.240169

华南理工大学学报(自然科学版) ›› 2025, Vol. 53 ›› Issue (4): 135-146.doi: 10.12141/j.issn.1000-565X.240169

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冷藏肉中致病菌的三重ERA快速检测

杨艳歌¹, 吴占文¹^,², 刘通¹, 王帅¹^,², 魏莹¹^,², 赵健淞¹^,², 李红娜¹, 李涛¹, 张峰¹

^1.中国检验检疫科学研究院国家市场监管重点实验室（食品质量与安全），北京 100176
^2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆 163000

收稿日期:2024-04-09 出版日期:2025-04-25 发布日期:2024-07-22
通信作者: 张峰（1974—），男，博士，研究员，主要从事分析化学研究。 E-mail:fengzhang@126.com
作者简介:杨艳歌（1984—），女，硕士，副研究员，主要从事食品质量与安全研究。E-mail： yange8602@126.com
基金资助:
国家重点研发计划项目(2022YFF1100900);中国检验检疫科学研究院基本科研业务费项目(2024JK031)

Triple ERA Rapid Detection Method for Pathogens in Refrigerated Meat Products

YANG Yange¹, WU Zhanwen¹^,², LIU Tong¹, WANG Shuai¹^,², WEI Ying¹^,², ZHAO Jiansong¹^,², LI Hongna¹, LI Tao¹, ZHANG Feng¹

^1.Key Laboratory of Food Quality and Safety for State Market Regulation，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China
^2.College of Life Science and Biotechnology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163000，Heilongjiang，China

Received:2024-04-09 Online:2025-04-25 Published:2024-07-22
Contact: 张峰（1974—），男，博士，研究员，主要从事分析化学研究。 E-mail:fengzhang@126.com
About author:杨艳歌（1984—），女，硕士，副研究员，主要从事食品质量与安全研究。E-mail： yange8602@126.com
Supported by:
the National Key Research and Development Program of China(2022YFF1100900)

摘要/Abstract

摘要：

肉类食品因富含营养，常成为微生物滋生的理想环境，即使在低温储存下，多数微生物也依然保持活性和保留部分毒力，故对肉类食品进行致病菌筛查至关重要。该研究基于酶促重组等温扩增技术（ERA），开发三重荧光ERA快速检测方法，并对方法的特异性、灵敏度、检出限进行性能分析，然后对市售冷藏肉开展方法的适用性验证，并与行业标准SN/T 1870—2016实时荧光聚合酶链式反应（PCR）方法进行结果比对。结果显示：成功构建了一种针对冷藏肉类中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌3种关键致病菌的三重荧光ERA快速检测方法；经过优化，该方法能在12 min内通过单次反应同时完成3种致病菌的快速检测；最低检出限低至10^-3 ng/μL；对于人工模拟污染样品，经过6 h的前增菌，采用该方法可同时检出污染量为1 CFU/mL的3种致病菌；对市售冷藏肉品的抽检结果显示，金黄色葡萄球菌检出率为19.35%，沙门氏菌检出率为12.90%，单核细胞增生李斯特氏菌检出率为6.45%，与行业标准SN/T 1870—2016的检测结果吻合，充分证明了该方法的准确性与适用性。该研究不仅有助于降低食源性致病菌引发的疾病风险，还可为未来食源性致病菌现场快速检测提供坚实的技术支撑。

关键词: 冷藏肉品, 食源性致病菌, 三重荧光ERA, 快速检测

Abstract:

Meat products, being rich in nutrients, often provide an ideal environment for microbial growth.Even under low temperature storage, most microorganisms remain active and retain partial virulence. Therefore, screening for pathogenic bacteria in meat products is crucial. This study developed a triple-fluorescence ERA (enzyme-mediated recombinase polymerase amplification) rapid detection method based on enzyme recombinase amplification (ERA) technology. Performance analyses were conducted on the method’s specificity, sensitivity, and detection limits. Additionally, the applicability of the method was validated using commercially available refrigerated meats and compared to the industry standard SN/T 1870—2016 real-time fluorescent polymerase chain reaction (PCR) method. The results show that a triple-fluorescent ERA rapid detection method was successfully constructed for three key pathogens: Staphylococcus aureus, Salmonella and Listeria monocytogenes. After optimization, the method could simultaneously detect the three pathogens within 12 min from a single reaction. The minimum detection limit is 10^-3 ng/μL. In artificially contaminated samples, after 6 hours of pre-enrichment, the method can simultaneously detect contamination levels of 1 CFU/mL for all three pathogens. The sampling results of commercially available refrigerated meat show that the detection rates for Staphylococcus aureus, Salmonella, and Listeria monocytogenes were 19.35%, 12.90%, and 6.45%, respectively, which align with the detection results of the industry standard SN/T 1870―2016. These fully demonstrate the accuracy and applicability of the method. This study not only helps reduce the risk of disease caused by foodborne pathogens but also provides solid technical support for future rapid detection of foodborne pathogens.

Key words: refrigerated meat products, foodborne pathogens, triple-fluorescence ERA, rapid detection

中图分类号:

TS207.4

杨艳歌, 吴占文, 刘通, 王帅, 魏莹, 赵健淞, 李红娜, 李涛, 张峰. 冷藏肉中致病菌的三重ERA快速检测[J]. 华南理工大学学报(自然科学版), 2025, 53(4): 135-146.

YANG Yange, WU Zhanwen, LIU Tong, WANG Shuai, WEI Ying, ZHAO Jiansong, LI Hongna, LI Tao, ZHANG Feng. Triple ERA Rapid Detection Method for Pathogens in Refrigerated Meat Products[J]. Journal of South China University of Technology(Natural Science Edition), 2025, 53(4): 135-146.

图/表 9

表1

实验用菌株信息"

编号	种类	菌株	拉丁名称	菌株号
1	金黄色葡萄球菌	金黄色葡萄球菌	Staphylococcus aureus	ATCC27664
2		金黄色葡萄球菌	Staphylococcus aureus	ATCC13565
3		金黄色葡萄球菌	Staphylococcus aureus	CMCC26003
4		金黄色葡萄球菌	Staphylococcus aureus	ATCC25923
5		金黄色葡萄球菌	Staphylococcus aureus	ATCC12600
6	沙门氏菌	鼠伤寒沙门氏菌	Salmonella typhimurium	ATCC14028
7		鼠伤寒沙门氏菌	Salmonella typhimurium	CMCC50013
8		肠道沙门氏菌	Salmonella enterica	ATCC10708
9		猪霍乱沙门氏菌	Salmonella choleraesuis	ATCC53885
10		猪霍乱沙门氏菌	Salmonella choleraesuis	CMCC50018
11	单核细胞增生李斯特氏菌	单核细胞增生李斯特氏菌1/2a血清型	Listeria monocytogenes	ATCC15313
12		单核细胞增生李斯特氏菌1/2b血清型	Listeria monocytogenes	IQCC22291
13		单核细胞增生李斯特氏菌1/2b血清型	Listeria monocytogenes	ATCC-BAA-751
14		单核细胞增生李斯特氏菌1/2c血清型	Listeria monocytogenes	ATCC19112
15		单核细胞增生李斯特氏菌4b血清型	Listeria monocytogenes	ATCC19115
16		单核细胞增生李斯特氏菌4e血清型	Listeria monocytogenes	ATCC19118
17		单核细胞增生李斯特氏菌4a血清型	Listeria monocytogenes	ATCC19114
18	其他致病菌	绵羊/伊氏李斯特菌	Listeria ivanovii	ATCC19119
19		格氏李斯特菌	Listeria grayi	ATCC25401
20		斯氏/西尔李李斯特氏菌	Listeria seeligeri	ATCC35967
21		英诺克李斯特氏菌	Listeria innocua Seeliger	ATCC33090
22		威尔斯李斯特氏菌	Listeria welshimeri	ATCC35897
23		马尔蒂氏李斯特氏菌	Listeria marthii	ATCC BAA-1595
24		大肠埃希氏菌O157：H7	Escherichia coli O157：H7	IQCC10193
25		大肠埃希氏菌	Escherichia coli	IQCC10138
26		宋内氏志贺氏菌	Shigella sonnei	ATCC29930
27		福氏志贺氏菌	Shigella flexneri	CMCC51571
28		小肠结肠炎耶尔森氏菌	Yersinia enterorcolitica	ATCC27729
29		副溶血弧菌	Vibrio parahaemolyticus	ATCC 33847
30		河流弧菌	Vibrio fluvialis	ATCC33809
31		溶藻弧菌	Vibrio alginolyticus	ATCC17749
32		铜绿假单胞菌	Pseudomonas aeruginosa	ATCC25619
33		荧光假单胞菌	Pseudomonas fluorescens	ATCC 17397
34		恶臭假单胞菌	Pseudomonas putida	ATCC17485
35		蜡样芽孢杆菌	Bacillus cereus	ATCC10876
36		枯草芽孢杆菌	Bacillus subtilis	ATCC11774
37		乙型溶血性链球菌	Streptococcus hemolytic-β	CMCC32210

表1

表2

图1

图 2

图 3

图 4

图 5

表3

表4

参考文献 28

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菌	名称	序列（5ʹ-3ʹ）	基因
金黄色葡萄球菌	金F	CTTATAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTCG	nuc
	金R	TCTATTTACGCCATTATCTGTTTGTGATGC
	金P^a	ACGCAAAGAGGTTTTTCTATTTCGCTAC［ROX-dT］A［THF］［BHQ1-dT］TGTTTAGTGTTAAC［c3-spacer］
沙门氏菌	沙F	ATATTACCAGATATATATTAGAGCAATGGAAAA	fimY
	沙R	ATAGCCGAGGTAGTTATCAGTTGTAATTATTG
	沙P^a	TTTAAGAAATGCCAAAGACTGCGCCTGCCG［HEX-dT］T［THF］［BHQ1-dT］CACTCTCCAACGCCG［c3-spacer］
单核细胞增生李斯特菌氏菌	单1F	TCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTC	hlyA
	单1R	GTTACCAGGCAAATAGATGGACGATGTGAAAT
	单1P^a	CATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGATCC［Cy5-dT］GA［THF］GG［BHQ2-dT］AACGAAATTGTTC［c3-spacer］
	单2F	GAAAATAAAGCACCATTTATAGAAAAACAAG	actA
	单2R	CACATTATTAGCTGGTTCGCTTTCTCCTAC
	单2P	CGGCCAATTGATATGCCGAGCCTACCAG［FAM-dT］A［THF］［BHQ1-dT］CCAAAAAGAAGTTACC［c3-spacer］
	单3F	CTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGC	hlyA
	单3R	CATCAATTACCGTTCTCCACCATTCCCAAGC
	单3P	CGTCCATCTATTTGCCWGGTAACGCRAGAAAT［FAM-dT］A［THF］T［BHQ1-dT］AATGTTTACGCYAAAG［c3-spacer］

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Triple ERA Rapid Detection Method for Pathogens in Refrigerated Meat Products

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培养时间/h	三重荧光ERA法			SN/T 1870 —2016
培养时间/h	金黄色葡萄球菌	沙门氏菌	单核细胞增生李斯特氏菌	金黄色葡萄球菌	沙门氏菌	单核细胞增生李斯特氏菌
2	―	―	―	―	―	―
4	―	―	―	―	―	―
6	+	+	+	+	+	+
8	+	+	+	+	+	+

编号	样品名称	金黄色葡萄球菌		沙门氏菌		单核细胞增生李斯特氏菌
编号	样品名称	实时荧光PCR	三重ERA	实时荧光PCR	三重ERA	实时荧光PCR	三重ERA
1	撒尿牛丸	—	―	―	―	―	―
2	牛筋肉丸	―	―	―	―	―	―
3	牛肉丸	―	―	―	―	―	―
4	鸡翅中	―	―	―	―	―	―
5	鸡翅尖	―	―	―	―	―	―
6	鸡小胸	―	―	+	+	―	―
7	鸡大胸	+	+	―	―	―	―
8	烤肠	―	―	―	―	―	―
9	腊肠	―	―	―	―	―	―
10	小香肠	―	―	―	―	―	―
11	猪里脊	―	―	+	+	+	+
12	猪肉馅	+	+	+	+	―	―
13	羊肉	―	―	―	―	―	―
14	羊肉卷	―	―	―	―	+	+
15	肥牛卷	―	―	―	―	―	―
16	牛排	―	―	―	―	―	―
17	猪腔骨	―	―	―	―	―	―
18	猪通脊	―	―	―	―	―	―
19	猪肋条	+	+	―	―	―	―
20	猪五花肉	+	+	―	―	―	―
21	饺子（猪）	―	―	+	+	―	―
22	饺子（羊）	―	―	―	―	―	―
23	饺子（牛）	+	+	―	―	―	―
24	烧麦（猪）	―	―	―	―	―	―
25	烧麦（羊）	―	―	―	―	―	―
26	牛肉馅饼	―	―	―	―	―	―
27	猪肉馅饼	+	+	―	―	―	―
28	羊肉馅饼	―	―	―	―	―	―
29	鸡米花	―	―	―	―	―	―
30	鸡排	―	―	―	―	―	―
31	羊排	―	―	―	―	―	―