树干毕赤酵母木糖还原酶Lysine270定点突变的理性设计

华南理工大学学报（自然科学版） ›› 2009, Vol. 37 ›› Issue (6): 79-83.

树干毕赤酵母木糖还原酶Lysine270定点突变的理性设计

曾琦锴林影翟志臣林小琼杜红丽

华南理工大学生物科学与工程学院, 广东广州 510006

收稿日期:2009-01-20 修回日期:2009-03-03 出版日期:2009-06-25 发布日期:2009-06-25
通信作者: 杜红丽（1975-），女，讲师，博士，主要从事分子生物学、基因组学和生物信息学研究．E—mail：hldu@scut．edu．cn E-mail:lanny003@163．com
作者简介:曾琦锴（1980-），女，博士生，主要从事酶学研究．
基金资助:
广东省自然科学基金资助项目（06300199）

Rational Design of Site-Directed Mutagenesis of Lysine270 in Pichia sfipitis Xylose Reductase

Zeng Qi-kai Lin Ying Zhai Zhi-chen Lin Xiao-qiong Du Hong-li

School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong, China

Received:2009-01-20 Revised:2009-03-03 Online:2009-06-25 Published:2009-06-25
Contact: 杜红丽（1975-），女，讲师，博士，主要从事分子生物学、基因组学和生物信息学研究．E—mail：hldu@scut．edu．cn E-mail:lanny003@163．com
About author:曾琦锴（1980-），女，博士生，主要从事酶学研究．
Supported by:
广东省自然科学基金资助项目（06300199）

摘要/Abstract

摘要： Lysine270是树干毕赤酵母木糖还原酶（PSXR）与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）形成结合口袋的关键氨基酸之一．为研究该位点对PsXR辅酶偏好性的影响，用其它19种氨基酸替代Lysine270，构建19种不同的木糖还原酶（XR）突变子，利用同源建模和分子对接的方法评价不同突变子与NAD^＋或NADP^＋之间的相互作用，并从中选择突变子K270R和K270N进行实验验证．突变基因及野生基因用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）在大肠杆菌内进行诱导表达，经纯化后进行酶学性质研究．结果发现：K270R突变使得XR与NADP^＋的结合能力降低，米氏常数Km由0．025mmol／L升高到0．050mmoL／L；K270N突变使得XR与NADP^＋不能结合．实验结果亦证实，通过理性选择得到的K270N突变子的辅酶依赖性由NADPH完全逆转为NADH．

关键词: 木糖还原酶, 定点突变, 辅酶偏好性, 生物信息学

Abstract:

Lysine270 has been found to be a key amino acid that forms the binding pocket of PsXR （Piehia stipitis xylose reduetase） with nieotinamide adenine dinucleo,Lide phosphate （NADPH） or with nieotinamide adenine dinucleotide （NADH）. In order to investigate the effect of Lysine270 on the PsXR coenzyme specificity, 19 XR mu- tants were produced by substituting 19 amino acids tot Lysine270, and the interaction between XR mutants and NAD^＋ or NADP ~ was assessed by means of homology modeling and molecular docking. Then, K270R and K270N mutants were chosen to perform the bioinformatic analysis. After being induced by isopropyhhio-β-d-galactoside （IPTG） in Escherichia coli （E. coli）, the xylose reduetases of wild type and mutagenesis were purified and finally used to investigate the enzymatic properties. The results show that K270R mutagenesis reduces the binding capability of XR with NADP^＋ and results in an increase of Michaelis constant from 0. 025 mmol/L to 0. 050 mmol/L; K270N mutagenesis makes XR bind with NAD^＋ only; and the coenzyme dependence of rationally-designed K270N completely reverses from NADPH to NADH.

Key words: xylose reductase, site-directed mutagencsis, coenzyme specificity, bioinformation

曾琦锴林影翟志臣林小琼杜红丽. 树干毕赤酵母木糖还原酶Lysine270定点突变的理性设计[J]. 华南理工大学学报（自然科学版）, 2009, 37(6): 79-83.

Zeng Qi-kai Lin Ying Zhai Zhi-chen Lin Xiao-qiong Du Hong-li . Rational Design of Site-Directed Mutagenesis of Lysine270 in Pichia sfipitis Xylose Reductase[J]. Journal of South China University of Technology (Natural Science Edition), 2009, 37(6): 79-83.

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