重组毕赤酵母细胞壁蛋白的抽提和分析

华南理工大学学报(自然科学版) ›› 2012, Vol. 40 ›› Issue (5): 101-106,120.

重组毕赤酵母细胞壁蛋白的抽提和分析

林影周新莹韩双艳^† 张莉叶燕锐郑穗平

华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006

收稿日期:2011-10-18 修回日期:2012-02-22 出版日期:2012-05-25 发布日期:2012-03-31
通信作者: 韩双艳(1976-)，女，博士，副教授，主要从事微生物与酶学研究．E-mail:syhan@scut．edu．cn E-mail:feylin@scut.edu.cn
作者简介:林影(1962-) ，女，博士，教授，主要从事微生物与酶学研究．
基金资助:
国家自然科学基金资助项目( 20976062) ; 国家自然科学基金青年基金资助项目( 30900017)

Extraction and Analysis of Cell Wall Proteins of Recombinant Pichia pastoris

Lin Ying Zhou Xin-ying Han Shuang-yan Zhang Li Ye Yan-rui Zheng Sui-ping

School of Biological Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,Guangdong,China

Received:2011-10-18 Revised:2012-02-22 Online:2012-05-25 Published:2012-03-31
Contact: 韩双艳(1976-)，女，博士，副教授，主要从事微生物与酶学研究．E-mail:syhan@scut．edu．cn E-mail:feylin@scut.edu.cn
About author:林影(1962-) ，女，博士，教授，主要从事微生物与酶学研究．
Supported by:
国家自然科学基金资助项目( 20976062) ; 国家自然科学基金青年基金资助项目( 30900017)

摘要/Abstract

摘要： 建立稳定有效的细胞壁蛋白( CWPs) 抽提方法，是开展毕赤酵母细胞壁蛋白质组学及甲醇代谢调控相关性研究的基础．为此，以具重组非共价结合壁蛋白Flo1p 絮凝素的酵母GS115 /KFS-CALB、具共价结合壁蛋白α 凝集素的酵母GS115 /KNS-CALB 和具重组共价结合壁蛋白Pir1 的酵母GS115 /Pir1-CALB 为对象，用热十二烷基磺酸钠( SDS) 、昆布多糖酶、氢氟酸吡啶和温和碱水解对上述壁蛋白进行抽提，结果表明: 3 种壁蛋白已成功地展示于毕赤酵母细胞壁的表面; 用这3 种毕赤酵母锚定蛋白展示脂肪酶，对细胞的生长状况影响不大，而对展示酶的表达量影响较大，GS115 /KFS-CALB、GS115 /KNS-CALB 和
GS115 /Pir1-CALB 的脂肪酶水解比酶活最高达855. 02、1239. 40 和210. 47 U/g( 以干细胞计) ; 热SDS 可有效抽提GS115 /KFS-CALB 上的Flo1p 絮凝素，昆布多糖酶和氢氟酸吡啶可释放GS115 /KNS-CALB 上的α 凝集素，而昆布多糖酶和温和碱可释放GS115 /Pir1-CALB上的Pir1．

关键词: 巴斯德毕赤酵母, 细胞壁蛋白, 非共价结合, 共价结合, 抽提方法

Abstract:

In order to explore a stable and effective extraction method of cell wall proteins ( CWPs) for the research on the cell wall proteome of Pichia pastoris and the related metabolic regulation of methanol,three kinds of yeasts,namely GS115 /KFS-CALB with recombined non-covalently-bonded cell wall Flo1p protein flocculin,GS115 /KNSCALB with covalently-bonded cell wall α lectin and GS115 /Pir1-CALB with recombined covelently-bonded cell
wall Pir1 protein,were used to extract cell wall proteins using hot SDS,laminarinase,HF-pyridine and mild alkali. The results indicate that the three types of CWPs mentioned above have successfully displayed on the cell wall of Pichia pastoris,that the three tpyes of anchored proteins all have little effect on the cell growth but great effect on the expression of displayed enzyme when they are used to display the lipase,and that the specific hydrolase activity of lipase of GS115 /KFS-CALB,GS115 /KNS-CALB and GS115 /Pir1-CALB are respectively up to 855. 02,1239. 40 and 210. 47 U per gram of dry cells. It is also found that hot SDS is effective in releasing the CWPs Flo1p flocculin of GS115 /KFS-CALB,that laminarinase and HF-pyridine are effective in releasing the CWPs α lectin of GS115 /KNS-CALB,and that both laminarinase and mild alkali are effective in releasing the Pir1 proteins of
GS115 /Pir1-CALB.

Key words: Pichia pastoris, cell wall protein, non-covalent bonding, covalent bonding, extraction method

中图分类号:

180.1710，180.6110

林影周新莹韩双艳张莉叶燕锐郑穗平. 重组毕赤酵母细胞壁蛋白的抽提和分析[J]. 华南理工大学学报(自然科学版), 2012, 40(5): 101-106,120.

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