可抑制 I 型胶原表达的siRNA 重组腺病毒的构建

doi:10.3969/j.issn.1000-565X.2013.12.016

华南理工大学学报（自然科学版） ›› 2013, Vol. 41 ›› Issue (12): 95-100.doi: 10.3969/j.issn.1000-565X.2013.12.016

可抑制 I 型胶原表达的siRNA 重组腺病毒的构建

姚咏嫦周嘉安陈晓峰^†

华南理工大学材料科学与工程学院，广东广州 510640∥国家人体组织功能重建工程技术研究中心，广东广州 510006

收稿日期:2012-10-23 修回日期:2012-12-13 出版日期:2013-12-25 发布日期:2013-11-19
通信作者: 陈晓峰(1956-)，男，博士，教授，主要从事生物医学材料研究． E-mail:chenxf@scut.edu.cn
作者简介:姚咏嫦(1979-)，女，博士，讲师，主要从事基因传递在组织再生的应用研究．E-mail:yaoyc@scut．edu．cn
基金资助:
国家自然科学基金青年科学基金项目(51303058);华南理工大学中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2011ZM0010);广东省自然科学基金资助项目(S2011040000208);教育部留学回国人员科研启动基金资助项目

Construction of Recombinant Adenovirus with siRNA Against Collagen I

Yao Yong- chang Zhou Jia- an Chen Xiao- feng

School of Materials Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China∥National Engineering Research Center for Tissue Restoration and Reconstruction,Guangzhou 510006,Guangdong,China

Received:2012-10-23 Revised:2012-12-13 Online:2013-12-25 Published:2013-11-19
Contact: 陈晓峰(1956-)，男，博士，教授，主要从事生物医学材料研究． E-mail:chenxf@scut.edu.cn
About author:姚咏嫦(1979-)，女，博士，讲师，主要从事基因传递在组织再生的应用研究．E-mail:yaoyc@scut．edu．cn
Supported by:
国家自然科学基金青年科学基金项目(51303058);华南理工大学中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2011ZM0010);广东省自然科学基金资助项目(S2011040000208);教育部留学回国人员科研启动基金资助项目

摘要/Abstract

摘要： 滑膜间质干细胞(SMSCs)与其他来源的间质干细胞相比，具有更强的生长能力和更大的软骨分化潜力．但由于 SMSCs 固有地表达 I 型胶原，这将会大大损害再生软骨的整体质量．为解决此问题，文中首先设计了可抑制 I 型胶原表达的 shRNA，并将其构建到腺病毒载体上．接着通过 Pac I 酶切反应，使重组腺病毒载体线性化并通过脂质体转染293 细胞进行病毒包装．收集的病毒初液进行滴度测定后，再次通过 293 细胞进行病毒扩增，经过纯化后，最终获得高滴度重组腺病毒．将重组腺病毒分别感染成纤维细胞和成骨细胞，通过荧光显微镜观察，检测转染效率，利用实时定量 PCR 实验验证 siRNA 的干扰效果．实验结果表明，包装后的重组腺病毒具有高的转染效率，能成功编译 siRNA，并具有抑制 I 型胶原表达的能力．

关键词: 滑膜间质干细胞, 腺病毒, siRNA, I 型胶原, 载体, 转染

Abstract:

As compared with the stem cells from other sources,synovium- derived mesenchymal stem cells(SMSCs) are of higher proliferative and chondrogenic ability.However,SMSCs express Collagen I inherently,which may impair the overall quality of the regenerated counterpart.In order to solve this problem,first,shRNAagainst Collagen I was designed and constructed in the adenoviral vector.Next,linear recombinant adenoviral vectorwas generated by the digestion with enzyme PacI and was used to transfect 293 cells for package. Then,the titrationof recombinant adenovirus was determined,and the corresponding amplification and purification were performed toobtain recombinant adenovirus with high titration.Moreover,fibroblasts and osteoblasts were respectively infectedby the recombinant adenovirus,and fluorescence microscopy was adopted to detect the transfection efficiency.Fi-nally,real- time quantitative PCR experiments were carried out to verify the targeting effect of siRNA.Experimentalresults show that the packaged recombinant adenoviruses are of high transfection efficiency and can successfully en-code siRNA against Collagen I.

Key words: synovium- derived mesenchymal stem cell, adenovirus, siRNA, Collagen I, vector, transfection

中图分类号:

Q782

姚咏嫦周嘉安陈晓峰. 可抑制 I 型胶原表达的siRNA 重组腺病毒的构建[J]. 华南理工大学学报（自然科学版）, 2013, 41(12): 95-100.

Yao Yong- chang Zhou Jia- an Chen Xiao- feng. Construction of Recombinant Adenovirus with siRNA Against Collagen I[J]. Journal of South China University of Technology (Natural Science Edition), 2013, 41(12): 95-100.

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可抑制 I 型胶原表达的siRNA 重组腺病毒的构建

Construction of Recombinant Adenovirus with siRNA Against Collagen I

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